酷霸被马力欧和路易吉击败、并被碧姬公主缩小后，他的儿子酷霸Jr.（本·萨弗迪 配音）为解救父亲并恢复家族荣光，绑架了彗星天文台的守护者罗莎塔公主（布丽·拉尔森 配音），企图抽取她创造生命的力量来为一门能毁灭宇宙的大炮提供燃料。一只奇可逃往蘑菇王国向碧姬公主和奇诺比奥求助，与此同时，马力欧（克里斯·帕拉特 配音）和路易吉（查理·戴 配音）受命调查沙漠小镇托斯特雷纳的骚乱，并在那里结识了恐龙耀西（唐纳德·格洛弗 配音）。
酷霸Jr.将碧姬的城堡升入太空，马力欧兄弟与耀西登上城堡后与之战斗，却导致城堡落入蜜糖星系。酷霸被多年未见的儿子劫走，但他对儿子的背叛行径感到后悔，并受到鼓舞重拾旧路，试图修复父子关系。
在追寻过程中，碧姬与奇诺比奥从赌场老板沃特口中逼问出罗莎塔的位置，随后与马力欧兄弟会合，并雇佣了飞行员火狐·麦克劳德（格伦·鲍威尔 配音）运送队伍。在对抗中，酷霸Jr.用超级瞄准镜将马力欧和路易吉变成了婴儿，后在耀西的帮助下才恢复原状。碧姬在天文台上发现自己与罗莎塔一样诞生于星尘，两人竟是失散多年的姐妹。
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